构建质粒载体的大体步骤是什么,怎样构建质粒？

网友回答

（1）根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。
　　（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。
　　（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。（具体步骤根据你们所用试剂盒上的说明书进行），切胶回收后还需电泳，看你回收后怎么样。
　　（4）拿着你的回收液与你的TA载体进行连接（具体操作见载体试剂盒说明书）
　　（5）连接后要转化进大肠杆菌感受态中。37℃ 200rpm 摇菌一个小时。
　　（6）之后涂布至固体培养基上。（培养基是带有抗生素的，这个抗生素的选择要根据你的载体来选）
　　（7）37℃倒置培养一夜
　　（8）第二天早上，挑取单菌落，进行菌落PCR，检测是否为假阳性。
　　（9）PCR之后如果条带正确，则摇菌，摇的就是你检测之后的那个单菌落。
　　（10）可以直接拿菌落测序，或者提取质粒测序。（记住要保存菌种）
　　（11）如果测序得到的序列确实为你最初设定的那个序列，则再摇你保存的那个菌种。
　　（12）提取质粒，做酶切。酶切的体系要看你所用的酶。
　　（13）酶切后还是需要进行回收。
　　（14）将回收的片段与你已经酶切好的表达载体的片段连接。
　　（15）再转化至大肠杆菌扩增。
　　（16）PCR检菌，酶切检菌。
　　（17）检菌正确，则你的表达载体构建完成。
　　
　　因为我不知道你是否要构建到表达载体中，还是构建到克隆载体就可以，所以后面说的不是很详细，但是大体的步骤就是这样，只要你会构建克隆载体了，后面的表达载体基本也没有问题了，只是多下些功夫就可以了。
　　我上面说的都是很简单的语言，只供参考，不能作为书面语。有什么问题可以再交流。

网友回答

分别将这两个基因插入到相应的载体中使用酶切，连接，转化，鉴定的方法就可以进行质粒构建了！