质粒的载体构建,很想知道质粒构建的详细步骤？

网友回答

pBR322质粒载体的构建过程可简单地概括如下：
　　1、由于pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒，故首先以pMB1为基础，引入Rldrd19质粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3质粒；
　　2、pMB3的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在EcoRI活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的DNA的黏性末端连接起来后就形成了pMB8质粒（2.6kb）；
　　3、此时，另外一种pSC101质粒在EcoRI活性条件下消化产生了含有tetr抗性的DNA片断，这个片断和pMB8整合在一起就形成了pMB9质粒（5.3kb）。此时pMB9为ampstetr表型；
　　4、pMB9已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，我们要让它具备amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以来也可以走，为了留住它，我们切去了Tn3中表达转位酶的基因，形成了pBR313质粒。
　　此后我们兵分两路：一路把pBR313的PstI位点除去，使之成为ampstetr表型的pBR318质粒；
　　5、；另一路把pBR313的EcoRⅡ的位点切除，使之成为amprtets表形的pBR320质粒。
　　由此我们的到了两种功能互补的质粒，这样我们只要将他们杂交就可以得到一种接近全能的载体质粒了，这就是pBR322。

网友回答

1. 通过PCR扩增目的基因片段
　　PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。
　　2. 酶切
　　根据引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收
　　3. 连接
　　通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接
　　4. 转化
　　将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜
　　5. 挑取单克隆，并鉴定
　　挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序