克隆和质粒构建是做什么的,重组质粒构建的注意事项？

网友回答

质粒是现代分子生物学中常用的载体之一，
　　质粒构建，就是指把特定的基因序列插入到工程质粒中。
　　但仅仅插入质粒是不够的，还需要把质粒转化到细菌、细胞或酵母中，使质粒在其中扩展或表达。以细菌为例，转化后的细菌还需涂布到平板，使之分散为单个细菌，在合适的条件下培养，单个细菌长成菌落，这时，这个菌落的所有的菌都是有一个细菌分裂而来，其状态和携带的质粒是一致的，就俗称一个“克隆”，用于后续实验。
　　从无性繁殖的角度来讲，上述的“克隆”和克隆羊的“克隆”概念是一致的。

网友回答

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下：
　　
　　1) 克隆基因的酶切位点问题
　　
　　2) 载体酶切的问题
　　
　　3) 连接片段浓度比的问题
　　
　　在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
　　
　　一、克隆基因的酶切位点问题
　　
　　1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
　　
　　2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
　　
　　一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。