植物组织中过氧化氢含量的测定,双氧水含量测定

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实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰e68a84e8a2ade799bee5baa6e79fa5e9819331333332633563酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
一、过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H2SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水
方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，加入试剂。

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色

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用典量法测定双氧水的含量。用正交试验方法确定双氧水的含量。
　　具体百操作是：在250毫升典量瓶中准确加入0.1mol/L双氧水度20ml，再加入一定量的KBr固体，
　　振荡使其溶解，加问入一定量的6mol/L的盐酸，立即盖上塞子，加水封，反映一定时间。接招加入一定量的碘化钾固体再立即盖上盖子，加水封，置于阴凉处答反映一定时间，立即用内0.1mol/L的硫代硫酸钠标准溶液滴定，用淀粉做指示剂，根据滴定结果，计算双氧水容的浓度。
　　n（双氧水）=0.5n（硫代硫酸钠）=0.5C硫代硫酸钠×V（硫代硫酸钠）