一个质粒携带有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因.利用卡那霉素抗性基因内部的EcoRI酶切位点进行人类生长激素基因的克隆.二者连接后转化对两种抗生素都敏感的大肠杆菌菌株.如何鉴别出那些细菌获得了质粒?那些细菌含有的质粒上携带有人类生长激素基因?
网友回答
【答案】 按照你的表述,EcoRI酶切位点是在卡那霉素抗性基因内部?
那么,如果这个抗性基因插入了你的目的基因,那么这个基因就被破坏,也就失去了卡那抗性.
所以,插入了目的基因的质粒,应该是只有氨苄抗性的.所以转化之后涂平板,不能用双抗,只能用氨苄抗性.
要鉴别是否插入目的基因,很简单：
1,菌落pcr：从转化平板上随机挑选几个菌落,用普通pcr体系,以菌体为模板,做pcr,然后跑胶鉴定.(我的经验,这一步阳性了就基本准了)
2,从菌落pcr阳性菌内提质粒酶切鉴定.（这个最准）
3,如果你实在是要求用抗性来筛（其实抗性筛选不是很准）,你用两种平板,一种是amp平板（也就是转化用的平板）,一种是amp+kan平板,你用接种环或者灭过菌的牙签,从amp转化平板上的菌落点一下,再在amp
+kan平板上原位点一下,培养.
如果同一个菌落,只能在amp上长,而不能在双抗上长,就可能是重组质粒.