简述Southern Blot杂交的原理、步骤及应用. 生物
网友回答
【答案】 原理
Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一.其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原 则形成双链,此杂交过程是高度特异的.由于核酸分子的高度特异性及检测方 法的灵敏性,综合凝胶电泳和 核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱.但为了进一步构建出DNA分子的遗传图, 或进行目的基因序列的 测定以满足基因克隆的特殊要求,还必须掌握DNA分子中基因编 码区的大小和位置.有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得.
步骤
1．琼脂糖电泳
（1）取一定量的待测DNA样品,用适当的限制性内切酶酶切.DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异,对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析,取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列,则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时,则需要30～50μg.
（2）酶切完毕,在琼脂糖凝胶中电泳.
（3）电泳结束后,EB染色,长波紫外线下观察电泳结果及照相.
2．印迹转移
（1）切胶并作标记（左下角切除）,以便于定位,然后将凝胶置于一容器中.
（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中,室温下放置1h 使之变性,不间断地轻轻摇动.
（3）将凝胶用去离子水漂洗1次,然后浸泡于适量的中和液中30 min,不间断地轻轻摇动.更换中和液,继续浸泡15 min.
（4）将滤纸,硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小,NC膜浸入转移buffer中平衡30 min.
（5）按右图操作：逐层铺平,各层之间勿留有气泡和皱折.
（6）虹吸转移12-16h.
3．固定DNA
（1）取出转移后的NC膜,用滤纸吸干NC膜,NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min.
（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上,中和两遍,每遍5min.
（3）将膜夹在两张干燥滤纸间,80℃烘烤1-2h.
4．预杂交
（1）将膜浸入5×SSC 中2min,将膜放入干净的塑料袋中.
（2）将预杂交液事先在65℃ 预热,然后将10 ml 预杂交液加入袋中,封口.
（3）65℃预杂交1h 以上,不时摇动.
5．杂交
（1）取出杂交袋,剪去一角去除杂交液后,加入5ml杂交液及5μl 变性探针,排除气泡后封口.
（2）将杂交袋放入65℃ 水中杂交过夜.
6．按下列条件洗膜
2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次
0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
7．免疫酶联检测
（1）偶联反应
①用中和液 洗膜2min,室温.
②用封闭液50ml洗膜30min,室温,轻摇.
③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至750 mU/ml ,将膜封入杂交袋,加入5 ml稀释抗体轻摇50min.
④用中和液 50 ml洗膜,10min ×2次,室温,轻摇,除去未结合的抗体.
（2）显色反应
①用平衡液20 ml平衡膜2min.
②将膜装入杂交袋中,加入5ml显色液,避光30min 左右,当出现颜色时不要晃动.
③用TE洗膜终止反应.
④80℃烤干.
应用
遗传病诊断,DNA图谱分析,检测样品中的DNA及其含量,PCR产物分析等.