16s高通量测序结果需要用qPCR进行验证吗？

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环境样本由于来源和条件不完全可控，每个样品之间会存在很大的差异，即便是相同样本的不同取样时间和部位也会存在一定的差异。基于高通量测序主要是为了了解样品的菌群构成和功能分析，以及寻找不同环境之间的差异，包括菌和功能基因以及代谢。如果仅做单一样本，很可能结论只能代表这个单一取样样本的信息，无法排除不同样本重复之间的差异，也就可能得不到真正代表环境差异的结果。所以环境样品不仅要重复而且还应该以分组方式取尽量多的样本以全面的代表一个环境条件下的各种变异情况。以人类肠道菌群为例，如果仅以2个样本进行属一级菌群显著性差异分析会得到50-70个显著的差异菌群，而以5-10个样本的分组之间进行比较一般获得的显著差异菌群会减少到3-10个。这表明之前以单样本比较找到的差异菌群很大比例是样本个体之间的差异，而不完全代表处理和环境之间的差异。环境样本的高通量测序包括以16s rDNA进行扩增测序的微生物菌群多样性测序还有一类是全部测序的宏基因组测序。我们目前的16s rDNA测序一个样本费用在350元左右，可以完成包括菌群检测、多样性分析和差异分析，还可以对样本的基因和功能进行预测分析，周期大概2周左右。而宏基因组费用大概在1万元左右，主要解决发现新基因，全面寻找代谢通路和新菌的基因组方面，周期要长很多基本上要2个月左右。所以我们建议的实验设计一般是首先选择尽量多和广泛代表性的样本然后进行16s rDNA测序，在对基本菌群构成和差异变化进行分析，获得较为明确的结果后可以选择差异菌群或功能基因的特异性引物进行样本的定量检测来进一步验证。最后对关键样本进行宏基因组或宏转录组测序完成新基因和基因标志物的挖掘。