【请问加减法测定DNA序列时是怎么从放射自显影的图谱上读出序列的?】

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DNA序列测定技术（双脱氧末端终止法）使用须知
(张宏、李振甫)
一、背景介绍
目前最常用的手工DNA序列测定技术,仍然是Sanger等(1977)提出的酶法,也称双脱氧末端终止法.这种方法生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组核苷酸都有共同的起点,却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度,各不相同的寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基,在待测DNA片段上的位置所决定.然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,经放射自显影后,从放射自显影胶片上,直接读出待测DNA上的核苷酸顺序.
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,亦是DNA序列测定技术的重要基础,可分离仅差一个核苷酸、长度达300-500个核苷酸的单链DNA分子.DNA序列测定的简便方法,为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础,时至今日,绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的.
除传统的双脱氧链终止法外,自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流.此外,新的测序方法亦在不断出现,如上世纪90年代提出的杂交测序法等.
二、双脱氧末端终止法测序步骤
(一)制备模板
有两种类型的DNA可以作为Sanger法测序的模板,即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA.
1、单链DNA模板 在一般情况下,可将靶DNA片段克隆于M13mp载体中,从M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳,只要细心掌握模板与引物的最佳比例,有经验的测序人员通过一次末端终止反应,能读取300-500个核苷酸序列.
2、经热变性或碱变性的双链DNA模板 利用双链质粒模板测序,其中有两个至关重要的因素,即模板的质量和聚合酶的种类.用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆,往往因为有污染而并不可取.高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备.其次是应采用高质量的聚合酶.一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列.
(二)引物 酶法测序反应中都有一个与模板链特定序列互补的寡核苷酸作为DNA合成的引物.不管是单链DNA作模板,还是用变性双链DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行设计与未知DNA序列互补的引物.通用引物可直接从厂商购买.
（三）DNA测序酶
该酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,是测定较长DNA的首选酶.市售的各种以该酶为基础的测序试剂盒,效果甚佳.
(四)放射性标记
传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物,但由于32p发射的高能β射线,常会引起二个问题：首先是放射自显影图谱条带扩散、分辨率低,限制了识读序列的数量和准确性；其次是32P衰变会导致DNA样品分解,通常都应在测序反应后24小时内进行电泳,否则无法获得好的结果.
近年来α-35S-dNTP被广泛采用,是由于35S产生较弱的射线,克服了32P的二大缺点.放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底,测序反应产物可在-20℃保存一周,而分辨率并不下降.
（五）测序胶的准备及电泳
1、硅化玻璃板
2、配置电泳试剂和缓冲液
3、凝胶液的配置
4、电泳5、电泳后凝胶的处理
(六)DNA序列的识读
DNA序列的识读: ①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等,并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始,如连续的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出现的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到这种序列,便可较快地确定目的序列的位置.
三、注意事项
尽管核酸序列测定方法越来越成熟、简便并且可以自动化,但事实上,对于一个片段较长、序列未知的待测核酸而言,仍然是一件耗时且繁琐的工作.对于一个待测DNA分子,要制定一个能够简捷准确的测定方案,一般可以从以下几个方面考虑：
1、DNA片段大小.
2、背景资料：是否清楚DNA限制性酶切图谱,是否有一段已知序列,是否具有重复序列等.
3、测序目的: ①测定未知序列；②确定重组DNA的方向与结构；③对突变(如点突变)进行定位和鉴定；④比较性研究,如比较同种病毒不同株系之间的基因差异.后3种测序目的称为确证性测序.
4、实验条件：如手工测序还是自动化测序,合成引物费用等.
由于单套测序反应所能准确测定的DNA序列最长一般仅300-400bp.因此,在进行序列测定之前,必须首先考虑待测DNA分子的大小,其次是所要测定的序列范围以及要求的序列精确程度等,再结合实验室的条件选择切实可行的克隆及测序方案.
DNA序列如何测定
一、常规DNA